استفاده از الگوهای پروتئینی در بررسی تنوع ژنتیکی برخی ارقام منتخب کلزا

مقدمه

پروتئین‎ها، محصولات نهایی مسیرهای ژنتیکی هستند که در مراحل مختلف حیات سلول و در پاسخ به نیازهای سلولی تولید و به سوی جایگاه‎های مناسب هدف‎گیری می‎شوند (Nelson and Cox, 2007). در میان انواع پروتئین‎های گیاهی، پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر (SSPs) که در سطوح بالا و در مراحل انتهایی نمو بذر گیاهان در آنها تجمع می‎یابند (Sánchez-Romero et al; 2002؛ (Sergeant et al., 2009 به عنوان ابزاری برای بررسی تنوع ژنتیکی بسیار مورد توجه قرار گرفته‎اند. مطالعه SSPs اطلاعات مهمی در مورد روابط خویشاوندی در گیاهان به ویژه گیاهانی با ارزش غذایی بالا به دست می‎دهد. به دلیل ثابت‎تر بودن نوع و میزان SSPs در بذرهای بالغ نسبت به سایر بافت‎های گیاهی (Magni et al., 2007)، تحلیل آنها می‎تواند ابزاری برای شناسایی ارقام و گونه‎های گیاهی باشد (Kakaei and Kahrizi, 2011). در مقابل، پروتئین‎های رویشی (VSPs) (پروتئین‎های موجود در بافت‎های رویشی گیاه مانند: ریشه‎ها، ساقه‎ها، برگ‎ها و غده‎ها) تحت تأثیر شرایط محیطی و تنش‎ها قرار می‎گیرند (Tamkoc and Arsalan, 2010).

کلزا (Brassica napus)، به خانواده چلیپائیان (Brassicaceae)، از گیاهان زراعی مهم در مدیترانه و برخی مناطق خاورمیانه متعلق است (Bybordi, 2010) که به عنوان یک گیاه دانه روغنی با ارزش در سراسر جهان کشت می‎شود (Sadia et al., 2009). درصد بالای پروتئین و اسیدهای چرب غیر اشباع مانند اولئیک اسید، همچنین میزان اندک اسیدهای چرب اشباع موجود در بذرهای این گیاه ارزش غذایی و اقتصادی آن را افزایش داده است (Nasr et al., 2006). کلزا دانه‎هایی با ۴۰ درصد روغن و حدود ۱۵ درصد پروتئین (به عنوان ترکیبات ذخیره‎ای اصلی) تولید می‎کند Norton and Harris, 1975)؛ Gunstone et al., 1995). مطالعات مولکولی و بیوشیمیایی، مسیرهای بیوسنتزی مسؤول تولید و تجمع پروتئین و روغن را در بذر B. napus مشخص کرده‎اند (Rawsthorne, 2002؛ Schwender and Ohlrogge, 2002؛ Hill et al., 2003؛ Schwender et al., 2003، Goffman et al., 2004؛ Kubis et al., 2004؛ Ruuska et al., 2004). با وجود اینکه امروزه استفاده از تکنیک‎های الکتروفورز دو بعدی (2-DE) و روش‎های شناسایی پروتئین به وسیله اسپکتروفتومتر جرمی (MS) گسترش یافته است Aebersold and Mann, 2003)؛ Gorg et al., 2003؛ (Agrawal et al., 2005، بررسی SSPs با استفاده از ژل الکتروفورز یک بعدی، به ویژه
SDS-PAGE، همچنان به عنوان روشی ساده، سریع، ارزان و رایج برای مطالعه و مقایسه تفاوت الگوی پروتئینی ارقام و گونه‎های مختلف گیاهی و تنوع ژنتیکی آنها مطرح است. از آنجا که بررسی تنوع ژنتیکی نقش مهمی در به نژادی ژنتیکی گیاهان ایفا می‎کند، کاربرد نشانگرهای پروتئینی نظیر SSPs در مطالعه تنوع ژنتیکی ژرم‌پلاسم به منظور استفاده در برنامه‎های اصلاح نباتات بسیار مورد توجه است (Javid et al., 2004). الگوی الکتروفورزی پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر در مطالعات قبلی نیز استفاده شده است. برای نمونه نشانگرهای پلی‌مورفیسم ژنتیکی گونه‎های Brassica در بنگلادش، ژاپن، چین و دانمارک با روش SDS-PAGE توسط Rahman و Hirata (2004) تشخیص داده شد. همچنین، Kakaei و Kahrizi (2011) به مطالعه پروفایل پروتئین‎های ذخیره‎ای دانه در ارقام مختلف B. napus و تنوع ژنتیکی آنها پرداختند.

با توجه به ارزش غذایی و اقتصادی بسیار بالای ارقام مختلف کلزا و به دلیل محدود بودن اطلاعات موجود در مورد تفاوت‎های پروتئینی (Rahman and Hirata, 2004) و تنوع ژنتیکی میان آنها، مطالعه حاضر به منظور تکمیل اطلاعات در زمینه آنالیزهای مقایسه‎ای و تنوع ژنتیکی ارقام مختلف کلزا به وسیله الکتروفورز یک بعدی (SDS-PAGE) صورت گرفته، شناسایی برخی ارقام منتخب کلزا با استفاده از نشانگرهای پروتئینی ذخیره‎ای بذر و مقایسه با پروتئینی‎های رویشی (برگ‌های لپه‌ای) انجام گردیده است. به دلیل وابستگی ‌جوانه‎زنی بذر به لپه‎ها به ویژه در مراحل ابتدایی رشد، الگوی پروتئینی برگ‌های لپه‌ای پس از گذشت پنج روز از کشت در محیط MS نیز توسط SDS-PAGE بررسی شد.

مواد و روش‎ها

مواد گیاهی و شرایط کشت

بذر چهار رقم کلزا (الایت، اکاپی، تاسیلو و زرفام) از مرکز تولید دانه‎های روغنی وزارت جهاد‎ کشاورزی استان اصفهان تهیه شد. دانه‎های بالغ هر رقم پس از ضدعفونی با الکل ۷۰ درصد به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه و آب ژاول 20 درصد به مدت ۱۵ دقیقه، ۴ تا ۵ مرتبه در زیر لامینار و تحت جریان هوای استریل شستشو و در محیط کشت MS (Murashige and Skoog, 1962) حاوی ۱ درصد آگار، ۳ درصد سوکروز کشت داده شدند. شیشه‎های کشت حاوی بذر در اتاق رشد با شرایط تنظیم شده دمایی و در فتوپریود 16/8 ساعت نور/تاریکی به مدت ۴ هفته قرار گرفتند تا گیاهان رشد نمایند و پس از پنج روز از برگ‌های لپه‌ای هر رقم به منظور استخراج پروتئین و ژل الکتروفورز یک بعدی استفاده شد.

استخراج پروتئین بذر و برگ‌های لپه‌ای

پس از جداسازی پوسته 50 بذر از هر رقم، لپه‎ها و رویان موجود در بذرها با استون چربی‎زدایی شده، پودر فاقد چربی (defatted powder) لپه‎ها و رویان حاصل از هر رقم پس از خشک شدن در دمای اتاق برای استخراج SSPs استفاده شد (Ehsanpour et al., 2010). استخراج پروتئین‎ با استفاده از بافر استخراج حاوی 50 میلی‌مولار تریس، اسیدیته 5/7، 1 میلی‌مولار DTT، 2 میلی‌مولار Na2EDTA، 3 میلی‌مولار
2-مرکاپتواتانول و به نسبت ۱ به ۳۰ (وزنی/حجمی) بر اساس روش Rostami و Ehsanpour (2009) انجام شد. سوسپانسیون حاصل به مدت ۲ تا ۳ ساعت روی شیکر مدل POLE IPI PARS با سرعت ۵۰ دور در دقیقه تکان داده شد، سپس به مدت 25 دقیقه در rpm ۱۰۰۰۰ و ۴ درجه سانتیگراد توسط سانتریفیوژ مدل 3k20 SIGMA سانتریفیوژ گردید. پروتئین‎های ذخیره‎ای موجود در محلول رویی هر رقم کلزا توسط استون سرد به نسبت ۱ به 4 (حجمی/حجمی) رسوب داده شد و به مدت 25 دقیقه در 20- درجه سانتیگراد نگهداری و مجدداً به مدت ۲5 دقیقه در rpm ۱۰۰۰۰ و ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. در نهایت، رسوب پروتئینی هر رقم به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق خشک شد و در ۴۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج مذکور همگن و به مدت ۱۵ دقیقه با شرایط قبلی سانتریفیوژ شد. به طور مشابه، استخراج پروتئین‎ از برگ‌های لپه‌ای کلزا (1/0 گرم بافت) صورت گرفت و در نهایت، رسوب پروتئینی هر رقم در ۵۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج مذکور همگن و به مدت ۱۵ دقیقه در rpm ۱۰۰۰۰ و ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ و برای اندازه‎‎گیری میزان پروتئین کل و بررسی الگوی پروتئینی استفاده شد.

سنجش پروتئین کل و SDS-PAGE

اندازه‎‎گیری پروتئین کل (mg/g defatted powder) بر اساس روش تغییر یافته Bradford (1976)، با استفاده از BSA به عنوان پروتئین استاندارد انجام (Olson and Markwell, 2007) و پس از یکسان‌سازی نمونه‎ها، الگوی الکتروفورزی (SDS-PAGE) پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر و پروتئین‎های برگ‌های لپه‌ای با استفاده از ژل جداکننده (separating) 5/12 درصد و ژل متراکم کننده (stacking) ۵ درصد به وسیله تانک الکتروفورز ساخت شرکت PEQLAB مدل 1614-45 و با استفاده از نشانگر پروتئینی Preotein ladder PLUS PS11 در ۱۳۰ ولت انجام شد. پس از رنگ‎آمیزی ژل با نیترات نقره (Salehi and McCarthy, 2002)، تراکم نسبی باندهای پروتئینی با نرم‌افزار ImageJ بررسی شد. روابط خویشاوندی ارقام Brassica بر پایه حضور یا عدم حضور باندهای پروتئینی در ژل به وسیله تحلیل خوشه‎ای UPGMA و ضریب Jaccard در نرم‌افزار NTSYSpc2 تحلیل شد (Rohlf, 2000).‎ همه آزمایش‎ها در ۳ تکرار انجام و داده‎های حاصل توسط نرم‌افزار Sigma state 2 و تحلیل ANOVA و آزمون دانکن در سطح معنی‎داری P<0.05 مقایسه شدند.

مشاهدات

اندازه‎گیری پروتئین محلول کل SSPs در لپه‎ها و رویان چهار رقم کلزا شامل الایت، اکاپی، تاسیلو و زرفام تفاوت معنی‎داری نشان نداد، در حالی‎ که پروتئین محلول کل برگ‌های لپه‌ای در برخی ارقام متفاوت بود. رقم تاسیلو بیشترین میزان پروتئین محلول کل را نسبت به سایر ارقام دارا بود و ارقام الایت و زرفام از نظر محتوای پروتئین کل تفاوتی نداشتند (شکل ۱).

شکل ۱- (A میزان پروتئین محلول کل پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر (SSPs) در لپه‎ها و رویان در چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc)؛ (B میزان پروتئین محلول کل برگ‌های لپه‌ای. dp: پودر فاقد چربی (defatted powder). داده‎ها میانگین ۳ تکرار±  Std و حروف نامشابه نشان‌دهنده اختلاف معنی‎دار در سطح P<0.05 بر اساس آزمون دانکن است.

بررسی الگوی پروتئینی بذر و برگ‌های لپه‌ای چهار رقم کلزا با استفاده از SDS-PAGE و آنالیز باندهای پروتئینی با نرم‌افزار ImageJ، تفاوت معنی‎داری در بیان نسبی ۶ باند پروتئینی در دانه‎ها و برگ‌های لپه‌ای ارقام کلزا مشخص کرد. نتایج این بررسی نشان داد که باندهای پروتئینی ۱ و ۲ به ترتیب با وزن تقریبی 110 و 80 کیلو دالتون در بذر ارقام تاسیلو و الایت کمترین سطح بیان و باند ۶ (۲۰ کیلو دالتون یا کمتر) در رقم اکاپی بیشترین سطح بیان را داشت. علاوه بر این، بیان باندهای ۳ (با وزن تقریبی 67 کیلو دالتون) و ۴ (با وزن تقریبی 62 کیلو دالتون) در رقم اکاپی قابل تشخیص نبود، در حالی که باند ۵ (با وزن تقریبی ۴۵ کیلو دالتون) در ارقام تاسیلو و الایت مشاهده نشد (شکل ۲).

نتایج بررسی الگوی الکتروفورزی پروتئین در برگ‌های لپه‌ای چهار رقم کلزا (شکل ۳) بیشترین میزان بیان باند ۱ با وزن تقریبی 80 کیلو دالتون را در رقم تاسیلو و سپس زرفام نشان داد. همچنین، باندهای ۲ (با وزن تقریبی 63 کیلو دالتون) و ۶ (با وزن تقریبی 3 کیلو دالتون) به ترتیب بیشترین سطح بیان را در ارقام تاسیلو و زرفام نشان دادند. افزایش سطح بیان باند ۴ (27 کیلو دالتون) در رقم تاسیلو تشخیص داده شد. باند پروتئینی با وزن مولکولی 63 کیلو دالتون (باند ۲) در رقم اکاپی مشاهده نشد در صورتی که بیان باندهای ۳ و ۵ به ترتیب با وزن تقریبی 51 و ۲۲ کیلو دالتون در رقم الایت تشخیص داده نشد. این بررسی نشان داد که رقم تاسیلو علاوه بر دارا بودن بیشترین محتوای پروتئین محلول کل نسبت به سایر ارقام، دارای بیشترین سطح بیان نسبی باندهای ۱، ۲ و ۴ نیز بود.

شکل ۲- (A الگوی الکتروفورزی پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر (SSPs) چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc) و M: نشانگر پروتئینی؛ (B آنالیز میزان بیان نسبی پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر چهار رقم کلزا. داده‎ها میانگین ۳ تکرار ±Std.

شکل 3- (A الگوی الکتروفورزی پروتئین‎های برگ‌های لپه‌ای چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc) و M: نشانگر پروتئینی؛ (B آنالیز میزان بیان نسبی پروتئین‎های برگ‌های لپه‌ای چهار رقم کلزا. داده‎ها میانگین ۳ تکرار Std ±.

بر اساس حضور و عدم حضور (غیاب) باندهای پروتئینی ویژه‎ای شامل باندهای ۳، ۴ و ۵ در الگوی الکتروفورزی پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر روابط خویشاوندی چهار رقم منتخب کلزا در این مطالعه بررسی شد. این نتایج نشان داد که ارقام تاسیلو و الایت دارای بیشترین شباهت با یکدیگر بوده، رقم اکاپی کمترین شباهت را با سایر ارقام داشت. همچنین، ارقام تاسیلو و الایت بیشترین شباهت را با رقم زرفام داشتند (شکل ۴).

شکل 4- دندروگرام بررسی روابط خویشاوندی بر اساس باندهای پروتئین‎های ذخیره‎ای بذر (SSPs) در بذر چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc). داده‎ها میانگین ۳ تکرار±  Std.

بحث و نتیجه‎گیری

در این مطالعه، محتوای پروتئین محلول کل در بذر هیچ کدام از ارقام منتخب کلزا تفاوت معنی‎داری با یکدیگر نداشتند. نتایج این بررسی با نتایج به دست آمده از مطالعه محتوای پروتئین محلول کل در چهار رقم پسته ایرانی مشابه بود (Ehsanpour et al., 2010). اثر پذیری پروتئین‎های موجود در بافت‎های رویشی گیاهان (VSPs) از شرایط کشت و تغییرات محیطی احتمالاً می‎تواند یکی از دلایل متفاوت بودن محتوای پروتئین محلول کل برگ‌های لپه‌ای بین ارقام مورد مطالعه کلزا در این تحقیق باشد.

پروتئین‎ها، ترکیباتی ضروری در اغلب عملکردهای سلولی هستند. شناسا‎گرهای پروتئینی به ویژه پروتئین‎های ذخیره‎ای موجود در بذر گیاهان (SSPs) به دلیل عدم تأثیر پذیری از شرایط محیطی (Magni et al., 2007) و پایدارتر بودنشان نسبت به پروتئین‎های موجود در بافت‎های رویشی، ابزار و تکنولوژی معتبر و قدرتمندی در شناسایی ارقام و گونه‎های گیاهی معرفی شدند Jha and Ohri, 1996)؛ Javid et al., 2004؛ Iqbal et al., 2005؛ Seferoglua et al., 2006؛ Criley et al., 2008). بنابراین، پروفایل الکتروفورزی پروتئین‎های ذخیره‎ای بذرها می‎تواند باندهای پروتئینی ویژه‎ای را به صورت نشانگر مطرح نماید (Razavizadeh and Ehsanpour, 2013). بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‎های گیاهی بر پایه نشانگرهای مولکولی مانند پروتئین‎ها می‎تواند در برنامه‎های اصلاح نباتات نقش تعیین‌کننده‎ای داشته باشد. در مطالعه حاضر، عدم بیان ۳ باند پروتئینی در ژل مربوط به دانه شامل باندهای 67 (باند ۳)، 62 (باند ۴) در رقم اکاپی و 45 کیلو دالتونی (باند ۵) در ارقام تاسیلو و الایت و نیز سه باند پروتئینی در ژل مربوط به برگ‌های لپه‌ای شامل باند 63 (باند ۲) در رقم اکاپی، ۵۱ (باند ۳) و ۲۲ کیلو دالتونی (باند ۵) در رقم الایت به عنوان نشانگرهای پروتئینی ارقام منتخب کلزا شناخته شد. به طور مشابه، در مطالعات قبلی، شناسایی واریته‎های Ipomoea (Das and Mukherjee, 1995)، ارقام پسته ایرانی (Ehsanpour et al., 2010) و برخی ارقام سویا (Razavizadeh and Ehsanpour, 2013) بر پایه مطالعه الگوی پروتئینی SSPs صورت گرفته است. علاوه بر این، شناسا‎گرهای پروتئینی SSPs به منظور بررسی روابط تاکسونومیک و تشخیص واریته‎های کشت شده برخی گونه‎های گیاهان مهم زراعی مانند: blackgram Ghafoor et al., 2002)؛ Ghafoor and Ahmad, 2005)، Capsicum annuum L. (Anu and Peter, 2003)،Solanum(Menella et al., 1999)، Vigna spp. (Rao et al., 1992)، Arachis hypogaea (Javid et al., 2004)، wheat (Siddigui and Naz, 2009) و Vigna unguiculata (Win et al., 2011) نیز به کار گرفته شده است. بنابراین، این دسته از نشانگرهای مولکولی قابل به کارگیری در تشخیص و جداسازی ارقام مختلف Brassica نیز هستند.

نتایج حاصل از بررسی روابط خویشاوندی بر پایه حضور یا عدم حضور باندهای پروتئینی خاص در ژل مربوط به دانه نشان داد که ارقام تاسیلو و الایت بیشترین شباهت را با یکدیگر را داشتند. مشابه با مطالعه حاضر، حضور و غیاب باندهای پروتئینی در مطالعات پیشین نیز برای تشخیص تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی گونه‎های عدس (Ahmad et al., 1997) و ارقام پسته ایرانی (Ehsanpour et al., 2010) استفاده شده است.

سپاسگزاری

نویسندگان لازم می‎دانند ازحمایت‎های دانشگاه پیام نور مرکز نجف‌آباد برای انجام این پژوهش قدردانی نمایند.