بررسی تنوع زیستی با روش تعیین زیستگاه ویژه و مقایسه الکتروفورزی پروتئین‌های بذر جمعیت‌های دو گونه بومادران (Achillea L.) در غرب ایران

مقدمه

تیره Asteraceae بزرگترین خانواده گیاهی (Bremer, 1994) شامل جنس‌ها و گونه‌های بسیاری است که در سراسر جهان پراکندگی دارند (Watanabe, 2002). Anthemideae جزو یکی از هفت تبار بزرگ این تیره با حدود ۱۰۹ جنس و حدود ۱۸۰۰ گونه در سطح جهان است (Tahir et al., 2002). این تبار در ایران، دارای ۱۲ جنس و حدود ۱۳۴ گونه است که از میان آنها Achillea، Anthemis، Artemisia و Tanacetum از مهم‌ترین جنس‌ها هستند (Rechinger, 1986). جنس Achillea یکی از جوان‌ترین جنس‌های تیره Asteraceae از نظر تکاملی است که در سراسر جهان حضور دارد و بیش از ۱۰۰ گونه در این جنس شناسایی شده است (Goli et al., 2008). این جنس، در مناطق مختلف ایران با ۱۹ گونه که ۷ گونه آن انحصاری ایران هستند پراکنش دارد (Mozaffarian, 2007).

تنوع زیستی، گوناگونی زندگی و فرآیندهای آن که شامل گوناگونی موجودات زنده، تفاوت‌های ژنتیکی میان آنها، اجتماعات و اکوسیستم‌هایی که در آن وجود دارند و فرآیندهای تکاملی و بوم‌شناختی است که آنها را فعال، در حال تغییر و سازگار نگه می‌دارند (Keystone Center, 1991). ایجاد تنوع درون و بین ‌گونه‌ای منشأ اصلی و ذخیره‌گاه گونه‌زایی است و به غنای تاکسون‌ها در یک منطقه منجر می‌شود (Atri et al., 2007). تاکنون بررسی‌های گیاه‌شناسان نشان داده است که افراد متعلق به یک گونه گیاهی کاملاً مشابه یکدیگر نیستند. لینه این تنوعات را در رابطه با اثر محیط و عوامل محیطی تفسیر می‌کرد که به دو صورت تنوع ژنتیکی (منشأ ارثی) و فنوتیپی (منشأ غیر ارثی) ظاهر می‌شود (Maassoumi and Assadi, 2004). بنابراین، مطالعه معیارهای بوم‌شناختی در ایجاد تنوع در زیستگاه‌های متفاوت یک منطقه امری ضروری است. با توجه به اینکه هدف پژوهش حاضر بررسی تنوع درون ‌گونه‌ای و بین ‌گونه‌ای است سعی شد از روشی استفاده شود که هم معیار تبارشناختی و هم معیار بوم‌شناختی در مرحله جمع‌آوری داده‌ها مد نظر قرار دهد. بر همین اساس، از روش تعیین زیستگاه ویژه DSS (Determination of Special Station) استفاده شد که الهام گرفته از جامعه‌شناسی گیاهی است (Atri, 2006). Quike (1993) روش الکتروفورز پروتئین‌های بذر و کاربرد آن در سیستماتیک و شناسایی تاکسون‌ها را توضیح داد و نشان داد که این روش می‌تواند ابزاری قدرتمند برای جدا نمودن تاکسون‌ها، ارتباطات بین تاکسون‌های معین و همچنین مشخص نمودن گونه‌ها، جنس‌ها، بخش‌ها و تیره‌ها به کار گرفته شود.

مواد و روش‌ها

برای بررسی تنوع زیستی (درون ‌گونه‌ای و بین ‌گونه‌ای) 21 جمعیت از گونه‌های A. biebersteinii و
A. tenuifolia از مناطقی از غرب کشور (استان‌های همدان و کردستان) با روش DSS جمع‌آوری شد که مراحل جمع‌آوری به شرح ذیل است:

1- انتخاب گونه‌های چند زیستگاهی

2- تعیین محل‌های پراکنش گونه‌های بررسی شده با مراجعه به فلورها

3- تعیین زیستگاه‌های عمومی

4- تعیین زیستگاه ویژه که با محوریت فرد گونه مورد بررسی و با روش سطح حداقل یا روش Cain و de Oliveira (۱۹۵۹) تعیین می‌شود. شایان ذکر است که در روش DSS، زیستگاه ویژه عبارت است از سطحی از پوشش گیاهی که بر اساس حضور گونه مورد نظر تعیین می‌شود و از نظر تبارشناختی- بوم‌شناختی یکنواخت است.

5- جمع‌آوری داده‌های فلوربستیک بوم‌شناختی از زیستگاه‌های ویژه که در این مرحله تمامی گونه‌های هم‌باش با فرد گونه مورد بررسی جمع‌آوری و کدگذاری می‌شود. همچنین، داده‌های بوم‌شناختی (از جمله: ارتفاع، درصد شیب، جهت شیب، نوع بستر و ...) نیز ثبت شد.

6- شناسایی نمونه‌های گیاهی

7- کدگذاری و تحلیل داده‌های تبارشناختی- بوم‌شناختی بر اساس ترکیب ‌گونه‌ای (به عنوان نشانگر تبارشناختی) با نرم‌افزار Anaphyto و روش FCA (Factoria Correspondence Analysis) انجام شد. داده‌های بوم‌شناختی نیز با نرم‌افزار MVSP با روش PCA (Principal Components Analysis) تحلیل شد.

8- گروه‌بندی زیستگاه‌های ویژه بر اساس نشانگر تبارشناختی

9- تعیین گونه یا گونه‌های تشخیصی

پس از تعیین و اثبات وجود تنوع درون ‌گونه‌ای و بین ‌گونه‌ای، به تعیین و تشخیص سطح و نوع تنوع با روش‌های مورفومتری، سیتولوژی، گرده‌شناسی، الکتروفورز و ... پرداخته می‌شود. در مطالعه حاضر، برای تعیین سطح تنوع و مقایسه گونه‌های مطالعه شده از الکتروفورز پروتئین‌های بذر روی ژل پلی اکریل ‌آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) استفاده شد (Hames and Rickwood, 1990). برای استخراج پروتئین‌ها از بافر فسفات سدیم (اسیدیته=7) استفاده شد. عصاره پروتئینی استخراج شده به نسبت مساوی با بافر نمونه مخلوط گردید و به مدت سه دقیقه در حمام آب گرم حرارت داده شد. ژل پلی اکریل آمید ۱۲ درصد تهیه و مقدار ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه در چاهک‌ها تزریق شد. پس از اتمام الکتروفورز، رنگ‌آمیزی با رنگ کوماسی بلو بریلیانت R₂₅₀ انجام شد. سپس، موقعیت هر نوار روی ژل به صورت کدهای یک و صفر که نشان‌دهنده وجود و عدم وجود نوار مربوط است مشخص گردید. کدهای به دست آمده با نرم‌افزار NTSYS روش complete lonkage و نرم‌افزار MVSP روش PCA تحلیل شد.

نتایج

نتایج بررسی‌های تبارشناختی

با مراجعه به زیستگاه‌های عمومی در استان‌های کردستان و همدان ۲۱ زیستگاه ویژه، برای گونه‌های
A. tenuifolia (۱۲ زیستگاه ویژه) و A. biebersteinii (۹ زیستگاه ویژه) تعیین شد (جدول ۱) و در مجموع، تعداد ۱۲۰ گونه گیاهی به عنوان گونه‌های هم‌باش از ۲۱ زیستگاه ویژه به عنوان ترکیب رُستنی‌ها شناسایی شد که فهرست کامل این گونه‌ها به صورت حضور (1) و عدم حضور (0) در هر یک از زیستگاه‌های ویژه در جدول ویژه‌ای وارد شد.

نتایج حاصل از تنوع درون گونه‌ای در
A. tenuifolia.

تحلیل زیستگاه‌های ویژه A. tenuifolia با نرم‌افزار Anaphyto با روش FCA بر اساس ترکیب رُستنی‌ها (به عنوان نشانگر تبارشناختی) به گروه‌بندی زیستگاه‌ها در شش گروه متمایز منجر شد (شکل 1). گروه I شامل زیستگاه‌های 1، 2، 4، 5 و 7، گروه II شامل زیستگاه 3، گروه III شامل زیستگاه 6، گروه IV شامل زیستگاه 8، گروه V شامل زیستگاه 9 و گروه VI شامل زیستگاه‌های 10، 11 و 12 است.

عوامل بوم‌شناختی نظیر: ارتفاع، جهت شیب، نوع بستر و ...) در هر زیستگاه ویژه بررسی و با نرم‌افزار MVSP با روش PCA تحلیل گردید (شکل 2، جدول ۲) که زیستگاه‌های ویژه این گونه را در شش گروه متمایز قرار داد.

جدول ۱- مشخصات مناطق جمع‌آوری گونه‌های A. tenuifolia (۱۲۱) و بقیه A. biebersteinii

جدول ۲- داده‌های بوم‌شناختی بررسی شده زیستگاه‌های ویژه گونه A. tenuifolia

برای تعیین نوع و سطح تنوع درون گونه‌ای از مطالعات الکتروفورزی استفاده شد. بدین منظور، پروتئین‌های بذر 12 جمعیت گونه A.tenuifoila بررسی و در مجموع، 13 نوار شناسایی شد (شکل ۳ و جدول ۳). در دندروگرام‌های حاصل از تحلیل داده‌های الکتروفورزی با دو روش UPGMA و Complete نشان داد که زیستگاه‌های ویژه این گونه در شش گروه قرار گرفته‌اند (شکل ۴). گروه I شامل زیستگاه‌های 1، 2، 4، 5 و 7، گروه II شامل زیستگاه 3، گروه III شامل زیستگاه 6، گروه IV شامل زیستگاه 8، گروه V شامل زیستگاه 9 و گروه VI شامل زیستگاه 10، 11 و 12 است. هر گروه دارای نوارهای خاص خود است که از گروه دیگر متمایز شده است. بنابراین، در بررسی الکتروفورزی گونه
A. tenuifolia می‌توان شش گروه پروتئینی معرفی کرد. کمترین تعداد نوار در زیستگاه‌های 3، 10، 11 و 12 و بیشترین تعداد آن در زیستگاه‌های 6، 8 و 9 مشاهده گردید. نوارهای 3، 6، 7 و 8 در تمام زیستگاه‌ها مشترک هستند که مربوط به پروتئین‌های ویژه گونه A. tenuifolia هستند. نوارهای 1، 2، 4، 5، 7، 9، 10، 11، 12 و 13 در بین جمعیت‌ها تنوع را نشان می‌دهد.

جدول ۳- داده‌های الکتروفورزی SDS-PAGE در جمعیت‌های بررسی شده A. tenuifolia

شکل ۳- الگوی الکتروفورزی نوارهای پروتئینی بذر جمعیت‌های گونه A. tenuifolia. اعداد هر ستون نشان‌دهنده کد زیستگاه ویژه است؛ M، نشانگر.

شکل ۴- دندروگرام حاصل از تحلیل داده‌های الکتروفورزی زیستگاه‌های ویژه گونه A. tenuifolia با روش UPGMA (A) و Complete (B).

نتایج حاصل از تنوع درون گونه‌ای در
A. biebersteinii.

برای تشخیص وجود تنوع درون گونه‌ای گیاه
A. biebersteinii با نرم‌افزار Anaphyto و روش FCA داده‌های فلوریستیکی به عنوان نشانگر فلوریستیک تحلیل شد و زیستگاه‌های ویژه این گونه گیاهی در شش گروه قرار گرفتند (شکل 5). گروه IB شامل زیستگاه 18، گروه IIB شامل زیستگاه 19، گروه IIIB شامل زیستگاه‌های 13،15، 14 و 16، گروه IVB شامل زیستگاه 17، گروه VB شامل زیستگاه 20 و گروه VIB شامل زیستگاه 21 هستند. جدول ۴ داده‌های بوم‌شناختی بررسی شده زیستگاه‌های ویژه گونه A. biebersteinii را نشان می‌دهد. تحلیل داده‌های بوم‌شناختی مطالعه شده زیستگاه‌های ویژه گونه گیاهی A.biebersteinii با روش PCA در شکل ۶ نشان داده شده است. با توجه به این شکل مشخص می‌شود که گروه‌بندی حاصل از تحلیل داده‌های بوم‌شناختی مطابق با گروه‌بندی حاصل از تحلیل داده‌های فلوریستیک است. الگوی نوارهای پروتئینی حاصل از مطالعات الکتروفورزی 9 جمعیت از گونهA. biebersteinii در شکل 7 ارائه شده است.

همچنین، نتایج حاصل به صورت کدهای صفر و یک در جدول ۵ و نمودار خوشه‌ای حاصل از تحلیل داده‌ها با روش UPGMA و Complete در شکل 8 نمایش داده شده است. زیستگاه‌های این گونه دارای 11 نوار پروتئینی است که کمترین تعداد نوار مربوط به زیستگاه 18 و بیشترین تعداد در جمعیت‌های 13، 14، 15 و 16 مشاهده شد. نوارهای شماره 7 و 14 در تمام زیستگاه‌های ویژه حضور دارند که به عنوان نوارهای اختصاصی این گونه معرفی می‌شوند. بنابراین، وجود شش گروه پروتئینی برای این گونه گیاهی مشخص شد.

شکل ۵- گروه‌بندی زیستگاه‌های ویژه گونه A. biebersteinii بر اساس ترکیب رُستنی‌ها با روش FCA

جدول ۴- داده‌های بوم‌شناختی بررسی شده حاکم بر زیستگاه‌های ویژه گونه A. biebersteinii

شکل ۶- نتایج حاصل از تحلیل داده‌های بوم‌شناختی زیستگاه‌های ویژه A. biebersteiniiبا روش PCA

شکل ۷- الگوی نوارهای پروتئینی عصاره بذر زیستگاه‌های ویژه گونه A. biebersteinii

جدول ۵- داده‌های الکتروفورزی SDS-PAGE در جمعیت‌های بررسی شده A. biebersteinii

شکل ۸- داده‌های الکتروفورزی حاصل از تحلیل داده‌های الکتروفورزی زیستگاه‌های ویژه گونه A. biebersteinii با روش UPGMA (A) و روش Complete (B). نخستین شاخه‌بندی در هر دو تحلیل در سطح فاصله 5/0 مشاهده شد.

نتایج حاصل از تنوع بین‌‌ گونه‌ای در A. tenuifoliaو A. biebersteinii

تحلیل و بررسی 21 زیستگاه ویژه شامل 12 زیستگاه ویژه برای A. tenuifolia و 9 زیستگاه ویژه برای A. biebersteinii بر اساس ترکیب رُستنی‌ها به عنوان نشانگر فلوریستیک با روش FCA، به گروه‌بندی این زیستگاه‌ها به دو گروه اصلی مجزا منجر شد. همان طور که مشاهده می‌شود زیستگاه‌های این دو گونه از نظر ترکیب فلوریستیک از یکدیگر جدا شده‌اند (شکل ۹).

شکل ۹- گروه‌بندی زیستگاه‌های ویژه گونه‌های A. tenuifolia و A. biebersteinii بر اساس ترکیب رُستنی‌ها با روش FCA

مقایسه عوامل بوم‌شناختی زیستگاه‌های ویژه این دو گونه نشان داد که از نظر ارتفاع، هر دو گونه در ارتفاعات مختلفی رشد می‌کنند و گونه
A. biebersteinii در محدوده ارتفاع بیشتری نسبت به گونه A. tenuifolia دیده می‌شود. A. tenuifolia تقریباً در تمامی جهات شیب رویش دارد، در حالی که گونه A. biebersteinii در جهت‌های شرقی، غربی و شمال‌غرب می‌روید. از نظر بستر نیز دو گونه از یکدیگر متمایز می‌شوند، گونه A. biebersteinii بیشتر در خاک‌های معمولی و مرطوب و به ندرت سنگی حضور دارد، اما گونه A. tenuifolia در بسترهای سنگی، سنگلاخی و شنی رویش دارد و از این نظر کاملاً با هم متفاوتند.

برای بررسی تنوع بین گونه‌ای دو گونه
A. tenuifolia و A. biebersteinii نوارهای پروتئینی زیستگاه‌های ویژه هر دو گونه به طور همزمان با نرم‌افزار NTSYS روش Complete و نرم‌افزار MVSP روش UPGMA تحلیل شدند. نوارهای پروتئینی هر دو گونه در جدول ۶ مشاهده می‌شود. نوار شماره 7 در تمام زیستگاه‌های بررسی شده دو گونه، مشترک است که نشان‌دهنده پروتئین یکسان در دو گونه و احتمالاً پروتئین اختصاصی جنس Achillea است. دندروگرام حاصل از تحلیل داده‌های الکتروفورزی در شکل ۱۰ نشان داده شده است. که در آن، گروه I و II به ترتیب نشان‌دهنده زیستگاه‌های ویژه گونه A. tenuifolia و
A. biebersteinii است. بررسی نتایج حاصل از مطالعات الکتروفورزی پروتئین‌های بذر نیز وجود تنوع بین گونه‌ای را نشان می‌دهد. وجود نوارهای 4، 5، 8، 12 و 13 که خاص زیستگاه‌های ویژه گونه
A. tenuifolia است و نوارهای 14، 15 و 16 که خاص زیستگاه‌های ویژه گونه A. biebersteinii است، این دو گونه را از نظر پروتئین‌های بذر در دو گروه مجزا قرار داده است. گروه I شامل زیستگاه‌های ویژه
A. tenuifolia و گروه II شامل زیستگاه‌های ویژه
A. biebersteinii.

جدول ۶- داده‌های الکتروفورزی SDS-PAGE در جمعیت‌های گونه‌های A. tenuifolia و A. biebersteinii

شکل ۱۰- دندروگرام حاصل از تحلیل داده‌های الکتروفورزی پروتئین‌های بذر دو گونه A. tenuifolia و A. bieberestinii با روش UPGMA (A) و روش Complete (B).